Святитель Серапион родился в подмосковном селе Пехорка в семье священника местного Покровского храма. О родителях его сведений практически не сохранилось. С раннего возраста Серапион хотел принять монашество, но родители были против этого решения. Уступая их желанию, он вступил в брак, а затем принял сан священства. Через год скончалась его жена, и Серапион постригся в монашество. Ради успокоения родителей он и после пострижения остался служить в той же приходской церкви. Когда родители скончались, Серапион отпустил работников на волю, раздал имущество бедным и поступил в Дубенский Успенский монастырь на острове, который был основан преподобным Сергием и состоял в ведении Троицкого монастыря. После кончины настоятеля братия упросили Серапиона принять на себя управление обителью. Новый игумен прославился своими духовными подвигами и столько потрудился для обители, что ее стали называть пустынью Серапиона.
Желая предаться богомыслию и строгому иноческому житию, Серапион сложил с себя настоятельство и перешел в Троицкий монастырь, которым управлял тогда игумен Симон (Чиж). В 1495 году, когда он получил назначение на Московскую кафедру, игуменом Троицкой обители по выбору митрополита и великого князя был поставлен Серапион.
Игумен Серапион проявлял большую заботу о правильном устроении монастырской жизни, был рачительным хозяином обители и пользовался уважением великого князя Иоанна III Васильевича. Однажды злые люди оклеветали перед ним трех боярынь, обвинив их в волшебстве. Иоанн III присудил их к сожжению. О помиловании невинно осужденных просили митрополит Симон (Чиж), духовенство и бояре, но безуспешно. Тогда игумен Серапион, помолившись Живоначальной Троице, Пречистой Богородице и преподобному Сергию, отправился в Москву. В разговоре наедине он со слезами умолял Иоанна III сохранить жизнь несчастным. Великий князь выслушал игумена, сменил гнев на милость и освободил женщин от наказания. О печаловании Серапиона узнали в народе. Его начали сравнивать со святителем Николаем Чудотворцем, спасшим узников от смертной казни.
15 января 1506 года повелением великого князя Василия III Иоанновича Серапион был хиротонисан в архиепископа Новгородского. Владыка управлял епархией в тяжелые для Новгорода времена, когда город постигли страшные бедствия — моровое поветрие и сильнейший пожар, унесшие жизни около двадцати тысяч человек. Непрестанно молясь о прекращении смертоносной болезни, святитель обходил город с иконами и крестами. Он повелел за день срубить и поставить церковь в честь Похвалы Богородицы на Детинце и в тот же день освятил ее. По молитвам святого архиепископа Господь исцелил трех человек — слепого, расслабленного и бесноватого. После этих чудесных исцелений эпидемия смертоносной язвы немедленно прекратилась. Во время пожара архиепископ вышел с крестным ходом на Волховский мост к Чудному кресту, но не мог выговорить и слова на молебне, только горько рыдал и тайно молился в глубине сердца своего, пока не утих огонь.
Святитель Серапион прошел и через другие испытания. В эти годы в ведении Новгородского владыки находилась Волоцкая обитель, игуменом которой был преподобный Иосиф. Волоцкий князь Феодор Борисович стал теснить иноков и приказал Иосифу удалиться, если он не пожелает исполнять княжеские распоряжения. Преподобный хотел было оставить игуменство, но, по просьбе братии, остался и решил просить защиты у великого князя Василия III Иоанновича. Игумен Волоцкой обители послал старца и к владыке Серапиону за благословением, но проникнуть в Новгород из-за моровой язвы было невозможно. Посланник вернулся ни с чем. Великий князь не сразу принял под свое покровительство Волоцкую обитель. Сначала он безуспешно пытался уговорить князя Феодора Борисовича, а затем собрал собор и по его решению принял обитель под свое покровительство, сказав игумену Иосифу; «Ты из предела Новгородской архиепископии не отошел; я взял монастырь твой только от насилия удельного князя, а к архиепископу сам пошлю, как минет невзгода».
Узнав о переходе Волоцкой обители к великому князю, архиепископ Серапион запретил игумена Иосифа в священнослужении и отлучил его от Церкви. Великий князь, прогневавшись за это на архиепископа, в 1509 году созвал собор, который постановил отстранить Серапиона от управления епархией и заточить его в Андроников монастырь.
Новгородцы скорбели о разлуке с добрым пастырем. Недолго пробыл у них святитель, но и за короткое время успел проявить себя радетелем об их духовных и телесных нуждах, помощником всем страждущим. После архиепископа Серапиона Новгородская кафедра оставалась вдовствующей семнадцать лет.
Незадолго до своей кончины митрополит Симон (Чиж) примирился со святителем Серапионом. В 1511 году владыка Симон пригласил его в Москву, благословил и сам принял от него прощение. Тогда же последовало и примирение святителя Серапиона с преподобным Иосифом. Великий князь Василий III Иоаннович смилостивился над владыкой и позволил ему переселиться в Троицкий монастырь, где святитель подвизался в посте, молитве, глубоком смирении и терпении. С великой любовью и честью приняли его там игумен Памва и вся братия, и возвеселился духом Серапион о водворении своем под кровом преподобного Сергия и Радонежских святых.
Еще при жизни Бог прославил Своего угодника дарами прозорливости и чудотворений. Святитель, например, провидел будущую судьбу своего любимого ученика архидиакона Иакова и поклонился ему, когда он был еще юношей, как игумену. Иаков действительно стал игуменом Троице-Сергиева монастыря и управлял обителью преподобного Сергия с 1515 по 1520 год.
В тот час, когда скончался преподобный Иосиф Волоцкий († 9 сентября 1515 г.), святитель Серапион, находившийся в Троице-Сергиевом монастыре, сказал бывшим с ним, внезапно показав рукою в сторону Волока Дамского: «Брат наш Иосиф преставился. Бог да простит его». И, молясь перед иконой Спасителя, добавил: «Не постави ему. Господи, греха, ибо бывает подобное и с праведными».
Перед кончиной святитель принял схиму. 16 марта 1516 года, простившись с братией и причастившись святых Таин, он скончался со словами на устах: «Господи, в руце Твои предаю дух мой». Необыкновенной радостью осветилось лицо почившего святителя. Со слезами погребли иноки владыку Серапиона близ церкви Живоначальной Троицы. Годом позже святые мощи его были обретены нетленными.
В Троицком монастыре местное почитание святителя Серапиона началось после 1559 года, когда его мощи были открыты, переложены в новый гроб и снова погребены. При этом произошло два чуда.
В 1608 году, когда польские захватчики, осаждавшие Троице-Сергиев монастырь, пытались взять его штурмом, три священноинока, а также многие другие монахи и мирские люди видели, как в церковь Святой Троицы вошел Серапион, архиепископ Новгородский. Был он в святительской одежде. Владыка Серапион встал в алтаре перед образом Пресвятой Богородицы. Матерь Божия, обратившись к нему, сказала: «Отец Серапион, почему ты с опозданием принес молитву всесильному Богу и Пресвятой Богородице?» Святой архиепископ, воздев руки, воскликнул: «О, Всепетая Мати, рождшая всех святых Святейшее Слово! Нынешнее приемши приношение, от всякия избави напасти всех». Так святитель Серапион явил свое заступничество монастырю, в котором прошла значительная часть его жизни.
В XVII веке установилось почитание владыки Серапиона в Новгородской епархии. В церковных грамотах 1628 и 1654 годов он призывается на помощь вместе с другими прославленными Новгородскими святителями. В чине поставления епископа 1646 года испрашивается заступление и архиепископа Серапиона. В настоящее время празднование памяти этого угодника Божия совершается всей Церковью. Святые мощи владыки покоятся под спудом в Серапионовой палате, на южной стороне Троицкого собора, где прежде располагалась келия преподобного Сергия.